¿Cómo están empleando los científicos la técnica CRISPR/Cas para abordar la pandemia?
La capacidad de emplear el sistema CRISPR Cas como herramienta de modificación genética es quizás una de los mayores logros del avance biotecnológico de los últimos años. De ahí que su uso médico genere tanta expectativa y se le considere, junto a la inteligencia artificial y la computación cuántica, uno de los pilares para el conjunto de cambios sociales conocidos como Cuarta Revolución Industrial.
En los últimos meses el planeta entero ha sido víctima de una pandemia que ha puesto en alerta a todos los gobiernos y que se ha tornado el nuevo reto de la biotecnología. Hallar un tratamiento eficiente y una vacuna para el SARS-CoV-2 son las consignas que movilizan a gran parte de la comunidad científica. Este escenario nos sitúa ante la pregunta ¿Cómo está apoyando el CRISPR/Cas en esta pandemia? Antes de responder esa pregunta veamos primero qué es exactamente el sistema CRISPR/Cas.
¿Qué es el CRIPSR/Cas?
La técnica de edición genética a través del sistema CRISPR/Cas consiste en la programación del sistema molecular CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para señalar regiones específicas de ADN y “cortar” las secuencias elegidas.
El CRISPR es un locus o secuencia de genoma que fue hallado en organismos unicelulares y desempeñaba la función de sistema inmunológico frente a infecciones virales. El sistema está compuesto por las secuencias CRISPR y un complejo proteico del tipo cas que se encargan de realizar el corte de la región genética objetivo.
Esta técnica es conocida principalmente por el uso de proteínas Cas9 para redirigir el sistema CRISPR a un punto específico de ADN y realizar una especie de corte molecular. Gracias al CRISPR/Cas9 es posible editar el genoma objetivo e insertar nuevas secuencias de ADN o simplemente eliminar una porción de esta. Debido a sus capacidades, la tecnología CRISPR/Cas promete el desarrollo de un gran número de nuevos tratamientos para afecciones de origen genético y diversas herramientas biotecnológicas.
Lo curioso de este sistema es que no solo existe la variedad Cas9, sino que el CRISPR puede ser complementado con otro tipo de proteínas. Es gracias a esta característica que 2 variedades del CRISPR han podido emplearse para tratar o diagnosticar al covid-19: el CRISPR/Cas13 y el CRISPR/Cas12. Ahora podemos explicar de qué van ambas y cómo nos sirven en esta pandemia.
CRISPR/Cas13
El año 2015, un estudio dirigido por Sergey Shmakov y Omar Abudayyeh describió por primera vez 3 sistemas nuevos de CRISPR/Cas de Clase 2: C2c1, C2c2 y C2c3. El sistema C2c2 era un sistema CRISPR capaz de afectar el ARN que, a diferencia del C2c1, demostró independencia de acción, pues no requirió de un trans-activador CRISPR ARN, molécula intermediaria, para cumplir su labor.
Años más tarde, el 2017, Abudayyeh y Gootenberg lograron emplear el sistema CRISPR clase 2 tipo VI C2c2, ahora conocido como CRISPR/Cas13, como un mecanismo de diagnóstico para la detección de ADN o ARN. Gracias a la programación de la enzima Cas 13 y su compatibilidad con el ARN, el mecanismo fue empleado para detectar diferentes cepas de virus del Dengue y Zika, bacterias patógenas y mutaciones tumorales. El sistema fue llamado SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) y es una paltaforma de detección de ácidos nucleicos basado en el sistema CRISPR/Cas13.
Ahora, el equipo ha publicado un pre-print en el que ofrecen posibles ensayos para la detección del SARS-CoV-2 haciendo uso de la tecnología CRISPR/Cas13. Como parte del estudio los científicos desarrollaron un modelo de machine learning denominado ADAPT con el que fue posible diseñar 67 ensayos para identificar diferentes especies de coronavirus. De aquellos ensayos, el equipo centró su atención en 4 ensayos diseñados para usar el sistema SHERLOCK, uno de los cuales demostró ser capaz de detectar 10 copias de ARN de SARS-CoV-2 sintéticos por microlitro tanto en pruebas de flujo lateral como fluorescente.
Los científicos Feng Zhang, Omar O. Abudayyeh y Jonathan S. Gootenberg del McGovern Institute for Brain Research del MIT han publicado un protocolo en el que se especifica el correcto uso del sistema CRISPR/Cas13 SHERLOCK en la detección del SARS-CoV-2. El protocolo no ha sido probado con muestras de pacientes infectados aún, pero ha servido para la detección de concentraciones de ARN viral sintético. El protocolo consta de 3 pasos y el proceso de detección del SARS-CoV-2 demoraría cerca de una hora.
Otra herramienta a disposición es la plataforma de detección múltiple y en simultáneo de patógenos CARMEN-Cas13. Esta herramienta ha sido descrita en la revista Nature y funciona gracias al análisis multiplexado que permite la combinación de la tecnología microfluídica auto-organizada y la detección basada en el sistema CRISPR. De acuerdo al estudio, la herramienta ha sido capaz de detectar la presencia del SARS-CoV-2.
CRISPR/Cas12
El año 2015 un equipo en el que participaron Abudayyeh, Gootenberg y Zhang reportaron las características de un sistema CRISPR clase 2 tipo V llamado Cpf1. Este sistema consiste de una endonucleasa guiada por ARN con características distintas al sistema Cas9 tales como la capacidad de ser procesada sin necesidad de una molécula adicional para actuar y la posibilidad de adherirse eficientemente al ADN objetivo gracias a su pequeño tamaño.
Posteriormente este sistema fue conocido como CRISPR/Cas12 y se descubrió un amplio árbol filogenético que incluía las variedades Cas12a hasta Cas12i en tres familias diferenciadas. La variedad Cas12g fue la de menor tamaño y la Cas12, por su composición bioquímica singular, se mostró con gran potencial para terapias de edición genética.
Hace unas semanas, un equipo de científicos publicó en la revista Nature Biotechnology el desarrollo de un sistema de detección para el SARS-CoV-2 basado en la tecnología CRISPR/Cas12 llamado SARS-CoV-2 DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter). El método consiste primero en realizar transcripciones inversas de ARN del virus en simultáneo, es decir generar ADN a partir del ARN extraído de muestras nasales u orales del paciente. Luego se procede a aplicar el sistema CRISPR/Cas12 en la muestra para detectar si la molécula Cas12, la cual ha sido programada para detectar los genes E (envoltura) y N (nucleoproteínas) del coronavirus, se ha adherido al ADN de la muestra. De adherirse el sistema confirmaría la presencia del virus.
Tal cual se ha descrito, la ingeniería genética también está presente entre los esfuerzos contra la pandemia. Si bien el CRISPR/Cas es un mecanismo tecnológico en desarrollo, los avances en sus distintas variedades y las posibles soluciones contra el SARS-CoV-2 que de ellos se derivan, nos recuerdan la importancia de que se profundice en sus estudios. Sobre todo porque sus bondades podrían ayudarnos a futuro a lidiar con otros posibles brotes de coronavirus o patógenos en general. Queda seguir a la espera de nuevos resultados.
Piero Gayozzo es Colaborador Especializado del Club N+1 para la Popularización de la Ciencia. Fundó y actualmente es Sub-Director del Instituto de Extrapolítica y Transhumanismo (IET). Escribe sobre la Cuarta Revolución Industrial para el IET y es investigador autodidacta de filosofía de la ciencia y de la tecnología. Llevó estudios de ingeniería industrial en la Universidad de Lima.
Sobre N+1: Es la primera revista online de divulgación científica y tecnológica que permite la reproducción total o parcial de sus contenidos por medios de comunicación, bloggers e influencers, realizando la mención del texto y el enlace a la web: “Esta noticia ha sido publicada originalmente en la revista N+1, ciencia que suma: www.nmas1.org”.
¿Que pueden aportar las herramientas de edición genética CRISPR en la investigación para detectar y derrotar al coronavirus SARS-CoV-2 causante de la COVID-19? Fotografía: Lluís Montoliu
En este artículo explicaré los dos grandes grupos de aplicaciones CRISPR para DIAGNOSTICAR y para COMBATIR el coronavirus.
Diagnóstico del coronavirus mediante CRISPR
La primera «aplicación» CRISPR para el nuevo coronavirus vino de la mano del laboratorio de Feng Zhang (BROAD-MIT, Boston, MS, USA), el inventor de la técnica de diagnóstico mediante CRISPR llamada SHERLOCK (nombre con evidente gancho y doble sentido, que es un acrónimo de las palabras en inglés Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing), y que su laboratorio describió en 2017. El diagnóstico mediante CRISPR y la técnica SHERLOCK está ilustrado en la figura que encabeza este artículo. Esencialmente el protocolo se basa en una nueva proteína efectora Cas, que ya no es Cas9 sino que es Cas13a, de otra bacteria. La Cas13a tiene la capacidad de cortar ARN (y no ADN, como Cas9), y de activarse gracias a una pequeña guía de ARN específica que sea complementaria al ARN que se quiere cortar y degradar. El grupo de Feng Zhang encontró que al activarse in vitro (en el laboratorio) esta RNAsa (nucleasa que degrada el ARN) esta parecía volverse loca y acababa cortando y degradando no solamente el ARN complementario diana sino todos los ARN que hubiera en el ensayo. Este hallazgo, que hubiera sido interpretado como un gran fiasco por la mayoría de investigadores, despertó la perspicacia y el talento de Feng Zhang, y acabó convirtiendo un resultado negativo inesperado en una nueva aplicación para diagnosticar la presencia de moléculas de ADN (y ARN) presentes en ínfimas cantidades en una muestra.
Esquema que ilustra el protocolo de diagnóstico de ADN mediante CRISPR-Cas13a, diseñado por el equipo de Feng Zhang (BROAD-MIT, EE UU) y denominado SHERLOCK. El mismo protocolo puede aplicarse para detectar ARN (p.e. el genoma del coronavirus SARS-CoV-2) simplemente saltándose el primer paso. Esquema realizado por Lluís Montoliu. Esta figura aparece ilustrando uno de los capítulos del libro «Editando genes: recorta, pega y colorea. Las maravillosas herramientas CRISPR«, Lluís Montoliu, NextDoor Publishers 2019.
La idea magistral que se oculta tras SHERLOCLK es la adición de unas pequeñas moléculas de ARN (de color morado en la ilustración de cabecera) que tienen en uno de sus extremos una moléculas fluorescente (F) y en el otro extremo una molécula inhibidora de esa fluorescencia (N). Cuando las dos moléculas F y N están juntas no se emite fluorescencia. Tras activarse el corte del ARN diana por parte de la proteína Cas13a, gracias a una guía específica de ARN, complementaria al ARN a detectar, la Cas13a no solo corta ese ARN sino todos los presentes en la mezcla, incluyendo las pequeñas moléculas de ARN de color morado. Estas, al partirse, liberarán las moléculas F y N por separado y, entonces, la molécula F podrá brillar y mostrar su fluorescencia, siendo posible detectar este brillo de luz mediante detectores lumínicos específicos. Dado que la fluorescencia no aparece hasta que se inicie la degradación de los ARN y, dado que esta degradación no se inicia si no es en presencia del ARN complementario a la guía ARN específica, el sistema SHERLOCK representa un método muy específico y sensible (se estima su sensibilidad en el orden de attomolar, esto es detecta una molécula de ARN que esté diluida hasta una concentración de 10[exp -18] molar) para detectar un ADN (que debe ser convertido primero a ARN mediante una transcripción in vitro) o un ARN (que no necesita ese primer paso y puede aplicarse directamente).
Efectivamente, a principios de este año, y tras conocerse la secuencia del genoma ARN del coronavirus SARS-CoV-2, causante de la COVID-19, el laboratorio de Feng Zhang hizo público un protocolo de detección del coronavirus mediante SHERLOCK y compartió el protocolo y los detalles técnicos para llevarlo a cabo en una publicación abierta a todo el mundo. El protocolo es relativamente sencillo (si se tienen todos los reactivos, fácilmente obtenibles desde Addgene y otros proveedores) y puede completarse en apenas 1 hora. La sensibilidad del método permite detectar hasta 10-100 moléculas del genoma del coronavirus por microlitro (~20-200 aM) Como ellos mismos indican en su protocolo de detección, este no está todavía homologado ni autorizado para aplicarlo en el diagnóstico clínico del coronavirus (algo que tendrá que aprobar eventualmente la FDA, tras realizar las revisiones y análisis correspondientes), pero si puede usarse de forma experimental, en los laboratorios. La empresa creada por Zhang «Sherlock Biosciences» está desarrollando el kit de detección y esperando poder aplicar esta tecnología para realizar diagnósticos masivos del coronavirus SARS-CoV-2 mediante SHERLOCK.
Párrafo añadido el 5 de mayo de 2020: Feng Zhang acaba de hacer público un nuevo método de diagnóstico optimizado y simplificado, derivado de SHERLOCK, aplicable para detectar el coronavirus SARS-CoV-2 directamente, sin mediar extracción o aislamiento de ARN, que apenas requiere de 40-70 minutos para obtenerse el resultado, tras una incubación a 60 grados. El nuevo método ha recibido el nombre de STOPCovid y puede ser un nuevo revulsivo en el paisaje actual de técnicas diagnósticas rápidas para detectar el genoma del virus de formas mucho más rápidas y simples que mediante RT-PCR. El límite de detección de este método es de unas 100 copias del ARN del coronavirus por reacción. En STOPCovid los autores combinan la técnica LAMP (siglas de Amplificación Isotérmica mediada por lazos) con el uso de la variante CRISPR-Cas12b
Tras el sistema SHERLOCK aparecieron dos métodos mejorados de diagnóstico genético mediante CRISPR, desarrollados por los laboratorios de Feng Zhang (SHERLOCKv2) y Jennifer Doudna (DETECTR), como expliqué en una entrada previa de este blog.
A principios de 2018, el laboratorio de Jennifer Doudna (UC Berkeley, CA, USA), una de las pioneras de la revolución CRISPR y sus aplicaciones en edición genética, desarrolló un test de diagnóstico genético CRISPR análogo a SHERLOCK pero basado en otra proteína Cas con propiedades similares a Cas13a. En este caso se trataba de la proteína Cas12a y al método resultante lo bautizaron como DETECTR (nombre también con doble sentido y cuidadosamente elegido, que es un acrónimo de las palabras en inglés DNA Endonuclease TargEted CRISPR Trans Reporter). En paralelo, el laboratorio de Feng Zhang respondió combinando hasta cuatro proteínas Cas con actividades RNAsa (Cas13b de dos bacterias distintas, Cas13a y Cas12a) para detectar hasta cuatro moléculas de ADN (o ARN) distintas, en un desarrollo tecnológico que llamó naturalmente como SHERLOCKv2. En una entrada anterior de este blog comparé y expliqué en detalle los dos sistemas de diagnóstico basados en CRISPR: DETECTR y SHERLOCK.
Naturalmente el sistema DETECTR también puede aplicarse para detectar el coronavirus SARS-CoV-2. Han aparecido publicaciones que usan la proteína Cas12a para diagnosticar la presencia del coronavirus de forma rápida, sencilla y asequible. Alguno de estos métodos que usan la proteína Cas12a es capaz de detectar el virus HIV, causante del SIDA, y el coronavirus SARS-CoV-2, simultáneamente. La empresa fundada por Jennifer Doudna, Mammoth Biosciences, de igual forma que Sherlock Biosciences, también está desarrollando sistemas de detección del coronavirus basados en la tecnología DETECTR, que anuncian que pueden ser todavía más rápidos, simples y programables.
Párrafo y tabla adjunta añadidos el 17 de abril de 2020: Ayer se publicó en la revista Nature Biotechnology el método que propone la empresa Mammoth Biosciences, basado en DETECTR, para detectar la presencia del virus SARS-CoV-2 mediante Cas12a. La tabla comparativa adjunta, que se incluye en este artículo, muestra las ventajas e inconvenientes de DETECR frente a la RT-PCR. En resumen, es más rápido (45 minutos por unas 3-4 horas) pero es menos sensible (10 copias del virus por microlitro frente a 1 copia del genoma viral que es capaz de detectar la RT-PCR). La diferencia adicional es que SHERLOCK puede procesar directamente la muestra del coronavirus (dado que Cas13a corta ARN) mientras que DETECTR necesita una etapa previa de retrotranscripción, de conversión de ARN a ADN, puesto que Cas12a corta ADN, no ARN. En ambos casos hay una fase de amplificación previa antes de cortar la secuencia problema.
Normalmente las herramientas CRISPR de edición genética son capaces de editar ADN. Esta es su aplicación más común y se la conoce con el nombre de aplicaciones CRISPR 1.0. Sin embargo algunas variantes de las herramientas CRISPR pueden también editar ARN, y son conocidas como las aplicaciones CRISPR 2.0. La figura representa un ejemplo de cada tipo. Esquema realizado por Lluís Montoliu. Esta figura aparece ilustrando uno de los capítulos del libro «Editando genes: recorta, pega y colorea. Las maravillosas herramientas CRISPR«, Lluís Montoliu, NextDoor Publishers 2019.
Combatir al coronavirus mediante CRISPR
Generalmente todos tenemos en mente que las herramientas CRISPR son capaces de editar cualquier secuencia de ADN. Y esto es cierto. Las variantes más comunmente utilizadas (CRISPR-Cas9) cortan y promueven la edición de ADN. Son las llamadas herramientas CRISPR 1.0. Adicionalmente, como he explicado en el apartado anterior, existen diversas proteínas Cas con capacidad de cortar ARN de forma específica. Algunas de ellas, como la Cas13b, han sido modificadas en el laboratorio, eliminando su capacidad de corte y combinándolas con actividades desaminasas que son capaces de cambiar directamente, químicamente, algún ribonucleótido específico (alguna letra concreta del ARN, la A por la G, o la C por la U), permitiendo la edición directa del ARN, lo que se ha venido a llamar las herramientas de edición CRISPR 2.0, como están ilustradas en la figura anterior. Estas herramientas (de las que existen diversas modalidades ya disponibles) podrían usarse, por ejemplo, para alterar la secuencia del genoma ARN del coronavirus SARS-CoV-2 mutando aquellos genes que le confieren la virulencia y, por ello, convirtiéndose en herramientas CRISPR para combatir la infección del coronavirus.
Uso de la proteína CRISPR-Cas13d incluida dentro de AAV, junto a guías de ARN específicas, para combatir el genoma ARN del coronavirus SARS-CoV-2 rompiendo la molécula de ARN del virus en diferentes partes y promoviendo con ello su degradación. Figura modificada de la publicación Nguyen et al. Cell Research (2020).
En febrero de este año apareció publicado en la revista Cell Research un artículo, lanzado desde la Facultad de Medicina de Harvard, en EE.UU., que postulaba un diseño terapéutico basado en Cas13d para combatir el coronavirus mediante CRISPR. Los autores de la propuesta habían localizado múltiples dianas para usar como complementarias a las guías ARN de la proteína Cas13d en el genoma del coronavirus SARS-CoV-2. Su propuesta incluía introducir dentro de partículas virales AAV (virus adeno-asociados, muy utilizados en terapia génica) el gen que codifica la proteína Cas13d y un bloque de expresión de tres guías de ARN que usaría la Cas13d para cortar el genoma del coronavirus. El AAV recombinante resultante podría administrarse por vía aérea, para que llegará fácilmente a los pulmones, entrara en las células cargadas de coronavirus y los destruyera. En teoría. Ahora falta demostrar en la práctica toda esta propuesta, de momento lanzada como una propuesta interesante, innovadora, pero teórica, todavía en desarrollo.
Otro estudio, este sí ya completado experimentalmente, desarrollado en la costa oeste de EE.UU., en la Universidad de Stanford, acaba de ser depositado en el servidor de pre-prints bioRxiv, el pasado 14 de marzo de 2020, y en él los investigadores también usan la estrategia de Cas13d para combatir a diferentes virus RNA. En este trabajo los autores prepararon una línea de células humanas epiteliales de pulmón a las que previamente transformaron con una construcción génica para que produjeran constantemente proteína Cas13d y un marcador fluorescente. Posteriormente estas células las transfectaban con nuevas construcciones capaces de producir las guías RNA que necesita la proteína Cas13d para cortar el ARN en posiciones específicas y exponían las células o bien a construcciones que simulan la infección con el coronavirus SARS-CoV-2 o a virus de la gripe (IAV), que también tiene moléculas de ARN en su genoma. En ambos casos tuvieron éxito, consiguiendo una degradación de las secuencias del ARN del SARS-CoV-2 y una inhibición en la replicación del virus de la gripe. Los autores bautizaron su método con el no menos ingenioso nombre de PAC-MAN (acrónimo de las palabras en inglés Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells). Los autores realizaron un análisis comparativo de los genomas de todos los coronavirus humanos conocidos y llegaron a encontrar seis moléculas de ARN que pueden actuar como guía para la proteína Cas13d, capaces de aparearse con secuencias comunes a todos los coronavirus conocidos que nos infectan a los seres humanos, lo cual, de poder verificarse, representaría una arma antiviral profiláctica y terapéutica extraordinariamente vesátil y poderosa, basada en herramientas CRISPR.
Aunque sabemos poco de las nuevas versiones CRISPR, de estas proteínas Cas13d, ya sabemos que pueden funcionar también bien in vivo, en animales. Miguel Ángel Moreno Mateos, investigador Ramón y Cajal de la Universidad Pablo de Olavide, en el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD) en Sevilla, ha demostrado, en un estudio reciente, depositado en bioRxiv el 14 de enero de 2020, que este sistema CRISPR-Cas13d funciona para reducir la expresión de genes específicos en embriones de pez cebra, de pez medaka, de pez killi y de ratón. Unos datos muy interesantes que permiten albergar esperanzas para su futuro uso en animales adultos y, eventualmente, si todos los análisis previos fueran exitosos, en personas.
Las herramientas CRISPR no dejan de sorprendernos. Han aparecido en los laboratorios, apenas hace siete años, y han venido para quedarse. Y la imaginación desbordante y sin límites de los investigadores hace el resto. ¡Larga vida a las CRISPR! ¡Mucho éxito diagnosticando y combatiendo a los coronavirus!
Este artículo ha sido actualizado dos veces: el 17 de abril de 2020 y el 5 de mayo de 2020.
Quizás la existencia de "nuestra" vida se base en un puñado de conexiones cuánticas, eso supondría que todo es una ilusión y que el ser humano construye guiado por una irracionalidad que creemos racional y certera cuando en realidad, deambulamos en universos inciertos, en una incertidumbre infinita sobre la que no tenemos ninguna clase de control.
Si Tu universo y Mi universo no forman parte del mismo universo. ¿Por qué cuando nos fundimos en un abrazo nuestro tiempo es el mismo?
Quizás en mi consciencia inconsciente y humanizada construyo espacios para poder sentirte y en modo de ilusión, intentar engañar a la magia de la relatividad.
